Der 1519 in Vézelay (Burgund) geborene Beza war Sohn eines königlichen Landvogts aus reichem Adelsgeschlecht. Er wurde in Paris von seinem Oheim, einem Mitglied des Parlaments, großgezogen und kam mit 9 Jahren zur Erziehung nach Orléans in das Haus des deutschen Humanisten Melchior Volmar. 1530 folgte er seinem reformatorisch gesinnten Lehrer nach Bourges, wo er Johannes Calvin erstmals begegnete. Von 1535 bis 1539 studierte Beza in Orléans Jura. Danach widmete er sich in Paris humanistischen Studien und verfasste eine Sammlung lateinischer Dichtungen. 1544 schloss er ein heimliches Verlöbnis mit einer jungen Frau bürgerlicher Herkunft, Claudine Denosse. Nach schwerer Krankheit und großer Seelennot entschied sich Beza endgültig für die Reformation, verzichtete auf seine Pfründen und flüchtete im Oktober 1548 mit seiner Verlobten nach Genf, wo er seine Ehe auf Anraten Calvins durch eine kirchliche Trauung legitimierte.

Seit Herbst 1549 lehrte Beza an der Akademie in Lausanne als Professor Griechisch und war von 1552-54 Rektor der Akademie. In dieser Zeit verfasste er seine bedeutendsten Werke. Gemeinsam mit Clement Marot entstand die französische Übersetzung der Psalmen, die seit 1562 von Loys Bourgeois vertont wurden und als „Hugenottenpsalter“ sehr große Verbreitung fanden.

Nach Auseinandersetzungen mit dem Berner Magistrat verließ Beza 1559 die Lausanner Akademie und wurde Prediger in Genf und Professor für Griechisch an der von Calvin gegründeten Genfer Akademie, deren erster Rektor er war.

1557/58 reiste er dreimal nach Deutschland, um eine Unterstützung der protestantischen Fürsten in Württemberg und der Pfalz für die verfolgten Hugenotten in Frankreich zu erreichen.

In mehreren Schriften reagierte Beza auf Angriffe deutscher Theologen gegen Calvins Abendmahlslehre, zuerst versöhnlich, später mit beißender Satire.

Ab 1560 hielt sich Beza längere Zeit in Frankreich auf. So trat er z.B. 1561 beim Religionsgespräch in Poissy als Wortführer der französischen Protestanten auf. Nach dem Blutbad von Vassy (1562) setzte er sich in Straßburg, Basel und bei den evangelischen Reichsfürsten für die verfolgten Hugenotten ein. Er schloss sich dem Heer des Prinzen Condé als Feldprediger an und begleitete dann Admiral Coligny. Nach dem Friedensschluss im März 1563 kehrte er nach Genf zurück. 1564 starb dort Calvin, dessen Nachfolger Beza kurz zuvor geworden war und dessen Schriften er später herausgab.

Eine intensive Korrespondenz verband Beza mit Theologen, Gelehrten und Regenten in ganz Europa. Als Rektor der Genfer Akademie sorgte er für die Ausbildung reformierter Prediger, die in West- und Osteuropa tätig wurden. Im April 1571 leitete Beza die Nationalsynode von La Rochelle und nahm im Mai 1572 auch an der Nationalsynode von Nîmes teil. Nach der blutigen Niedermetzelung der Hugenotten in Paris, der sog. Bartholomäusnacht, vertrat er in seiner Schrift „Du droit des magistrats“ ein Widerstandsrecht des Volkes gegen eine tyrannische Herrschaft.

Neben umfangreichen exegetischen Schriften beteiligte er sich 1560–1588 an der Genfer Bibelübersetzung. Außerdem veröffentlichte Beza zahlreiche polemische Schriften, etwa gegen Sebastian Castellio, die polnischen Antitrinitarier, vor allem aber gegen einige deutsche Lutheraner (Johannes Brenz, Nikolaus Selnecker, Matthias Flacius, Jakob Andreä). 1586 kam es auf dem Kolloquium in Mömpelgard/Montbeliard zu einer Begegnung mit Andreä; das Gespräch über das Abendmahl endete jedoch im unversöhnlichen Gegenüber der beiden Lager.

Nach dem Tod seiner ersten Frau, Claudine Denosse, heirate Beza 1588 seine zweite Frau, Katharina Plania von Asti. 1598 legte Beza sein Lehramt aus Krankheitsgründen nieder, 1600 zog er sich auch aus dem Pfarramt zurück. Am 13.10.1605 starb er in Genf und wurde in der Kathedrale St. Pierre begraben.